El estudio de la morfología celular y tisular requiere de muestras de tejido que puedan visualizarse al microscopio. Para que una muestra sea visible al microscopio, debe atravesar un proceso de preparación. Existen diversos procesos de preparación, también conocidos como técnicas histológicas, que incluyen múltiples pasos a llevar a cabo para obtener, preservar y preparar una muestra, para que esta sea apta para ser estudiada por microscopia óptica. La técnica más utilizada para el estudio de tejidos es la técnica histológica de parafina, que consta de 10 pasos principales.
Uno de los pasos más variados de este proceso es la tinción, siendo la tinción más comúnmente utilizada hematoxilina-eosina. Esta tinción acido-base es principalmente utilizada para mostrar características estructurales de los tejidos, al teñir los componentes celulares según su pH, pero no permite distinguir ciertos componentes estructurales específicos de los tejidos por lo que existen tinciones especiales para ello. La variedad de técnicas histológicas es lo que permite el estudio a profundidad de todos los tejidos.

 

Preparación del Tejido

 

La técnica histológica de parafina tiene como finalidad preservar las características intrínsecas del tejido para ser estudiadas por microscopia óptica. Los pasos de esta técnica son los siguientes:

1. Obtención de la muestra:
Los tejidos para estudio histológico se obtienen habitualmente a partir de:

• Autopsia: obtención de muestras de órganos y tejidos de un cadáver en las primeras 24 horas con el fin de investigar la causa del fallecimiento.

• Biopsia: porción de tejido obtenida de un individuo vivo para su estudio histológico o anatomopatológico, con el objetivo fundamental de diagnosticar una patología que no se ha podido diagnosticar por los métodos clínicos habituales.

• Citología: conjunto de células independientes procedentes de un tejido y extendidas sobre un portaobjeto formando una capa delgada lo cual permite su observación microscópica. Ejemplos: frotis de sangre, exfoliación de mucosa cervical, etc.

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2. Fijación:

Se emplean químicos individuales o mezclas de ellos para conservar la estructura del tejido de forma permanente. El fijador más usado es la formalina tamponada, una disolución de formaldehido más soluciones buffer; siendo el otro fijador de uso más común el fijador de
Bouin, una mezcla de ácido pícrico y ácido acético. Los fijadores tienen como principales objetivos:

• Preservar la estructura celular y tisular

• Endurecer el tejido

• Impedir la degradación enzimática (autolisis)

• Destruir microorganismos patógenos

• Impedir el metabolismo celular

3. Deshidratación:

Se utilizan una serie de soluciones de alcohol etílico en concentraciones de incremento gradual hasta alcanzar el 100%, con el objetivo de remover el agua del tejido vivo, ya que la parafina no es soluble en agua. Se utilizan disoluciones con concentraciones de alcohol que aumentan de forma gradual de 50, 70, 80, 90, 95, 97 y 100%. La muestra fijada se deja en la primera disolución 2 horas y en cada disolución subsiguiente por una hora para permitir una correcta deshidratación. El uso de alcohol etílico para la deshidratación de la muestra obedece a su solubilidad en solventes orgánicos no polares.

4. Aclaramiento:

La parafina tampoco es soluble en alcohol etílico, al ser un derivado de hidrocarburos, por lo que se remueve el alcohol utilizando xilol, xileno, tolueno o benzol. Estos derivados del benceno son químicos miscibles tanto en alcohol como en compuestos orgánicos como la parafina. Este proceso se lleva cabo dejando la muestra en uno de estos derivados del benceno de 30 a 45 minutos. El tejido se torna transparente luego de este paso, de ahí el nombre de aclaramiento.

5. Inclusión:

Se coloca el tejido en un recipiente con parafina fundida a 60 C o por aproximadamente 2 horas, hasta que se infiltra completamente. La alta temperatura ayuda a evaporar el agente de aclaración y facilita la entrada de la parafina al tejido. Al enfriarse la parafina a temperatura ambiental se endurece, formando un bloque que incluye el tejido. Estos bloques se forman con la ayuda de barras de Leuckart que sirven como moldes para su formación.

6. Corte:

Mediante un instrumento llamado micrótomo (ver imagen), el bloque de parafina se corta en rebanadas finas de 2-5 micras de grosor. Estos cortes se colocan en un portaobjetos de vidrio con la ayuda de un medio de montaje (adhesivo) como pineno, albumina o resinas de
acrílico. Cortes de grosor mayor a 5 micras no permiten la correcta visualización del tejido, ya que la luz debe atravesar la muestra para que sea visible en el microscopio óptico.

7. Desparafinado:

La parafina debe extraerse del tejido para que este pueda ser teñido, ya que los colorantes utilizados son hidrosolubles. Para ello, se utiliza cualquiera de los derivados del benceno previamente mencionados, xilol, xileno, tolueno o benzol. Este proceso se lleva cabo
dejando el portaobjetos con la muestra en uno de estos derivados del benceno de 30 a 45 minutos.

8. Rehidratación:

El xilol, xileno, tolueno y benzol no son solubles en agua, por lo que el tejido debe rehidratarse para que pueda ser teñido. Se rehidrata la muestra en disoluciones con concentraciones decrecientes de alcohol etílico de 100, 95, 90, 80, 70 y 50% para luego utilizar 100% de agua destilada. La muestra fijada se deja en cada disolución por una hora y en la última 2 horas para permitir una correcta rehidratación.

9. Tinción:

Con la muestra rehidratada, se aplican los colorantes necesarios para poder visualizar los componentes y estructuras tisulares de interés. La tinción de rutina usada en la mayoría de tejidos es la Hematoxilina-Eosina. Esta tinción tiñe selectivamente los componentes celulares ácidos y básicos de distintos colores. La hematoxilina es un colorante básico que tiñe sustancias acidas de color azul/morado; dicha tonalidad de coloración se conoce en histología como basófila. Otros colorantes básicos son el azul de toluina, verde de metilo y el azul de metileno. Por su parte, la eosina es un colorante acido que tiñe las sustancias básicas de color anaranjado/rosado; dicha tonalidad de coloración se conoce en histología como eosinófilo. Otros colorantes ácidos son fuscina, azul de anilina y naranja G.

10. Montaje:

Por último, se deshidrata una vez más la muestra con el mismo procedimiento que se utilizó previamente. La muestra se pasa por tolueno o xileno, que permite colocar un medio de montaje no hidrosoluble (Bálsamo de Canadá u otra resina) y así fijar el cubreobjetos.
Posterior a este paso, la muestra de tejido esta lista para ser visualizada en un microscopio óptico.

 

Tinciones Especiales

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➯ Tinción de PAS (Ácido Peryódico de Schiff): el ácido peryódico reacciona con grupos glicoles en los azúcares oxidándolos y transformándolos en aldehído, que interacciona con el reactivo de Schiff. Esta tinción da una coloración magenta o púrpura intenso, a todas las estructuras celulares compuestas por carbohidratos.

➯  Tinciones liposolubles (Sudan III y IV):  la tinción es más liposoluble que hidrosoluble, por lo que se disuelve y concentra más en los lípidos presentes en la muestra que en el resto de ella. Estas tinciones son utilizadas para colorear estructuras ricas en lípidos de color rojo intenso o rojizo anaranjado.

➯ Sales argénticas: utilizadas para teñir fibras de la matriz extracelular que reaccionan con el catión plata y lo convierten en plata metálica, como las fibras reticulares. Las fibras reticulares se tiñen de negro.

➯ Tricromico de Masson: es una tinción formada por 3 colorantes diferentes, que permite visualizar con cierta claridad colágeno y tejido muscular. Está compuesta de hematoxilina, fuscina ácida y azul de anilina o verde luz. El colágeno y por ende el tejido conectivo se tiñe de color azul o verde azulado y el músculo de color de color rojo; gracias a la presencia de la hematoxilina los núcleos seteñirán de morado en ambos tipos de tejido.